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激光共聚焦顯微鏡的校準是確保成像質(zhì)量和精度的關(guān)鍵步驟。以下是幾種常見的校準方法：
1. 掃描畸變校正
掃描畸變是激光共聚焦顯微鏡常見的問題，通常由掃描系統(tǒng)中的機械誤差引起。一種有效的校準方法是采用標準光柵試件進行全場校正。具體步驟如下：
根據(jù)光柵樣品的柵距和掃描線數(shù)計算掃描區(qū)域的大小。
對標準光柵樣品進行掃描，形成掃描云紋圖像。
通過移動樣品臺使光柵樣品發(fā)生特定位移，記錄不同相移量下的云紋圖像。
利用云紋相移技術(shù)計算出相位圖，并解包裹得到原始相位圖。
根據(jù)相位函數(shù)計算出掃描畸變場，從而實現(xiàn)校正。
這種方法具有精度高、操作簡單、實時測量且可進行全場測試等優(yōu)點。
2. STED系統(tǒng)校準
對于配備STED（受激發(fā)射損耗）功能的激光共聚焦顯微鏡，校準是確保超高分辨率成像的關(guān)鍵。STED系統(tǒng)每次開機后需要進行校準：
將物鏡切換到100倍，并確保STED激光和至少一條普通激光開啟。
在軟件中點擊“Align Beams”按鈕，系統(tǒng)會自動進行校準。
校準完成后，軟件會顯示“Alignment successful!”。如果校準失敗，可以調(diào)用預設的校準設置重新進行校準。
3. 光學參數(shù)校準
光學參數(shù)的校準包括激光強度、針孔大小、探測器靈敏度等。這些參數(shù)需要根據(jù)樣品的熒光特性進行調(diào)整：
激光強度：根據(jù)樣品的熒光強度調(diào)整激光功率，以避免光漂白和光毒性。
針孔大�。赫{(diào)整針孔直徑以平衡圖像的分辨率和亮度。
探測器靈敏度：根據(jù)熒光信號強度調(diào)整探測器的增益，以提高信噪比。
4. 數(shù)字圖像處理校正
對于微小的配準誤差，可以使用數(shù)字圖像處理方法進行校正。大多數(shù)激光共聚焦顯微鏡的軟件都具備這種功能，可以在圖像采集后對誤差進行修正。
通過以上校準方法，可以確保激光共聚焦顯微鏡在成像過程中提供高質(zhì)量、高分辨率的圖像。
https://lifescience.evidentscientific.com.cn/zh/landing/objectives/research/confocal/
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