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便攜式葉綠素測(cè)定儀測(cè)定物質(zhì)的葉綠素a含量。其實(shí)如果市面上已經(jīng)有哦很多款儀器，可以直接測(cè)定葉綠素的含量，葉綠素測(cè)定儀或者也叫做SPAD502。分光光度法大致操作：抽濾，丙酮提取，研磨，離心四個(gè)步驟。以下是分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素的整個(gè)過程。
根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。
根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的光密度D與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即：D=kCL式中：k為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，k為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)可通過測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的光密度而求得。
如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總光密度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下光密度的總和，這就是光密度的加和性。測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的光密度D，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。
已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又知在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長(zhǎng)645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：
D663 = 82.04Ca+9.27Cb （1）
D645 = 16.75Ca+45.60Cb （2）
式（1）、（2）中的D663和D645為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663nm和645nm時(shí)的光密度，Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg/L為單位。解方程組（1）、（2），得：
Ca = 12.72D663 – 2.59D645 （3）
Cb = 22.88D645 – 4.67D663 （4）
將Ca與Cb相加即得葉綠素總量（CT）：
CT = Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663 （5）
另外，由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5），也可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次光密度（D652）而求出葉綠素a、b總量：
CT =（D652 × 1000）/ 34.5 （6）
在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時(shí)測(cè)定出溶液中類胡蘿卜素的含量。
Lichtenthaler等對(duì)Arnon法進(jìn)行了修正，提出了80%丙酮提取液中三種色素含量的計(jì)算公式：
Ca = 12.21D663 – 2.81D646 （7）
Cb = 20.13D646 – 5.03D663 （8）
Cx·c=（1000D470 – 3.27Ca – 104Cb）/ 229 （9）
式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cx·C為類胡蘿卜素的總濃度；D663、D646和D470分別為葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)663nm、646nm和470nm下的光密度。
由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)，計(jì)算公式也有所不同。葉綠素a、b在96%乙醇中最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為665nm和649nm，類胡蘿卜素為470nm，可據(jù)此列出以下關(guān)系式：
Ca = 13.95D665 – 6.88D649 （10）
Cb = 24.96D649 – 7.32D665 （11）
Cx·c=（1000D470 – 2.05Ca – 114.8Cb）/ 245 （12）
用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素的值，是相對(duì)比較客觀和可信的，它所測(cè)出的結(jié)果較葉綠素含量?jī)x精確地多。因此，如果時(shí)間允許，而且又有比較專業(yè)的人員負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)過程，我們盡量不采用儀器測(cè)量，而采用國(guó)際通過的分光光度計(jì)。
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